养基,将种子罐中的菌种压到主发酵罐中,接种后37℃恒温培养发酵。本设计生产工艺采用通气发酵,搅拌式发酵罐,发酵20-24h[9]。发酵完毕后下罐。Р⑧固液分离Р发酵液下罐后需要进行固液分离。本设计采用立式离心机进行分离,弃上清液,保留固体即菌体本身。Р2.分离纯化的工艺设计Р①菌体的破碎Р大肠杆菌表达的蛋白在菌体的内部,需要将菌体细胞进行破碎。细胞破碎的方法有很多。这里采用反复冻融法破碎细胞。其具体方法为将菌体团装入保鲜袋中,压平。放入冷库中-20℃冷冻。24小时后取出在15℃下融化。待完全融化后再放入冷库中冷冻4-5小时,取出后融化,放入含有缓冲液的桶中,用搅拌器搅拌以破碎菌体,释放蛋白。Р②蛋白液的超滤Р将含有菌体碎片的溶液,进行超滤。Р③蛋白质的粗纯化Р首先将裂解超滤过的溶液稀释到电导小于3.0ms/cm。然后过Q Sepharose F.F弱阴离子交换柱。本次过柱采用TE(Tris-HCl-EDTA)为缓冲液,采用含有NaCl的TE缓冲液为洗脱液进行洗脱。洗脱方式为梯度洗脱法。收集适当波段的溶液。接着将收集到的溶液稀释到电导小于3ms/cm。过DEAE-Spharose 弱阴离子交换柱。本次过柱仍采用TE作为缓冲液,采用含有NaCl的TE缓冲液作为洗脱液进行梯度洗脱,收集适当波段的蛋白质溶液。紧接着将蛋白质溶液稀释到小于3mg/ml。用硫酸铵将其电导调到11.3左右,进行高盐上样,过Phengyl Sepharose 疏水柱,让后用低浓度的盐溶液进行洗脱,收集适当波段的蛋白质溶液。此步骤下样完毕后需对收集的蛋白液进行盐析,以便进行离心脱去其中的盐分。收集沉淀。Р④蛋白质的精纯化Р将离心脱盐的沉淀,用PB溶液溶解,然后再次离心脱去其中的盐分,收集上清液。上清液中含有大量目的蛋白。然后上清液过Sephacry s-100 分子筛。用PB盐溶液洗脱后,收集适当波段的溶液。
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