5 葡聚糖凝胶柱层析分离纯化蛋白质［精选PPT］

学目标Р了解:层析技术的基本原理;? 有效分配系数Kav的计算。?理解:葡聚糖凝胶的选择和准备。?掌握:凝胶层析的原理和操作方法;? 有效分配系数Kav的意义。Р重点:? 凝胶层析的原理和实验步骤。? 分配系数与被分离分子量之间的关系。Р难点:? 掌握装柱,加样,洗脱,收集样品的操作步骤。Р蛋白质的分离纯化Р蛋白质分离纯化的方法很多,主要是根据蛋白分子之间特异性的差异,如分子大小,溶解度,电荷等建立起来的。Р性质Р方法Р分子大小Р透析、超滤、密度梯度离心、凝胶层析等Р溶解度Р等电点沉淀、盐析、有机溶剂沉淀等Р电荷Р电泳、离子交换层析等Р吸附性质Р吸附层析Р对配体分子的亲和力Р亲和层析Р凝胶层析(又叫分子筛层析或排阻层析)指混合物随流动相经过装有凝胶作为固定相的层析柱时,各组分因分子大小不同而被分离的技术。Р凝胶层析的基本原理Р凝胶层析的过程Р凝胶层析过程的数理关系Р凝胶干体积VgР外水体积VoР内水体积ViР柱床体积VtР= 1/4 D2hР= Vg + Vo + ViР洗脱体积(Ve):自加入样品时算起,到组分最大浓度出现时所流出的洗脱液体积。Р凝胶层析的分配系数Р分配系数Kav:表示任何一种被分离的化合物被凝胶排阻的程度。?Kav与凝胶柱的总体积Vt、外水体积Vo、洗脱体积Ve有关:Р Vt和Vo恒定,Ve随分离物分子量的变化而变化Р思考:为什么分离物分子量越大Kav值越小РKav = (Ve — Vo)/(Vt — Vo)Р?Р葡聚糖凝胶柱层析法的特点Р天然凝胶:一些糖类物质,如淀粉、琼脂及琼脂糖等。?人工合成凝胶:葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶两大类。Р葡聚糖凝胶(Sephadex):由许多右旋葡萄糖单位通过?1,6-糖苷键联结成链状结构,再由交联剂交联形成不溶?水的多孔网状高分子化合物。Р型号:G200、 G150、 G100、 G75、 G50、 G25、 G15