C下; Р(2)相比:上下相体积比称为相比 R = V上/ V下Р三、实验器材与试剂Р1. 器材Р天平,台式离心机,10 mL刻度离心管,移液管,容量瓶,试管等。Р2. 试剂Р糖化酶,聚乙二醇400,硫酸铵和考马斯亮蓝等。Р四、操作方法Р1、蛋白质在两相中的分配Р在10 mL刻度离心管中,用电子天平称取硫酸铵固体1.30 g,聚乙二醇400液体2.00 g,用吸管加入已稀释的糖化酶液2.00 mL,然后加水,直到总量为8.00g,用橡皮塞塞紧试管口,用力振摇数分钟,使硫酸铵完全溶解,并使两相充分混合,以便酶在两相中的分配达到平衡,然后,用台式离心机离心3 min,转速调节至3000 r/min,分别读出上、下相的体积,求相比R,并用考马斯亮蓝比色法测定两相中的蛋白质浓度,求出分配系数Р。Р2、考马斯亮蓝比色法测定蛋白质含量Р制作标准曲线。Р样品测定方法如下:Р上相液:吸取上相液0.5 mL,用水稀释定容到50 mL,取1 mL稀释液于试管中,按标准曲线相同的方法加入考马斯亮蓝溶液并比色测定。Р下相液:吸取下相液0.1 mL于试管中,加蒸馏水0.9 mL,然后,按相同方法操作。Р根据在595 nm波长下所测得的吸收值,由标准曲线线性方程和不同的稀释倍数,计算出上、下相中蛋白质浓度,计算分配系数。Р五、思考题Р(一)预习Р1、配制双水相萃取系统时,聚乙二醇400液体的加量能否改为量取相应的体积?说明理由。Р2、用比色法分析上、下相蛋白质浓度时,如何精确吸出在同一离心试管中的上、下两相?写出操作步骤。Р(二)实验结果和讨论Р1、将比色分析的操作过程及结果列成表格,做标准曲线图,并做线性回归。Р2、求上、下相蛋白质浓度及分配系数K,求出相比R,计算该两相系统中聚乙二醇和硫酸铵的含量。Р3、在配制双水相系统时为什么必须充分混合?混合不充分会带来什么影响?Р4、分析引起实验误差的因素。
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