质的电荷被中和,与离子交换剂的亲和力降低,不同的蛋白质按所带电荷的强弱逐一被洗脱下来,达到分离的目的。Р5Р6Р三、实验的主要材料? ? 市售干酵母粉Р四、实验的主要试剂? 1、石英砂(助研磨作用)。? 2、 95%乙醇(沉淀杂蛋白)。? 3.、 DEAE—Sepharose FF(弱碱性阴离子交换剂,用于蛋白质分离)。? 4、 20mmol/LpH7.3Tris-HCl缓冲溶液(简称buff,用以维持蔗糖酶液的最适pH。)? 5、 0.5 mol/L NaCl (调节溶液离子强度)。? 6、3,5-二硝基水杨酸试剂(作为还原糖显色剂)。?甲液:溶解6.9g 结晶酚于15.2ml 10%NaOH溶液中,并用水稀释至69ml,在此溶液中加6.9g亚硫酸氢钠。?乙液:称取255克酒石酸钾钠加到300ml 10%NaOH溶液中,再加? 入800ml 1%3,5-二硝基水杨酸溶液.甲,乙二溶液相混合即得黄色试剂,贮于棕色瓶中备用,在室温放置7-10天以后使用。Р7Р五、实验的主要仪器? 1.冷冻离心机? 2.研钵? 3.恒温水浴箱? 4.-20℃冰箱? 5.梯度混合器? 6.层析柱(1×20cm)Р8Р六、实验操作流程? 干酵母粉→加缓冲液研磨→离心→热处理→酒精沉淀→离心→上清夜→上DEAE—Sepharose FF柱→层析→活力检测Р9Р七、实验关键步骤:(以下各步骤除热处理一步外,尽可能低温)Р 第一部分样品的制备:?1.称取10.0克干酵母粉于研钵内,加3.0克石英砂, 10ml buff(先量取总体积buff30 ml),在研钵内研磨成糊状,约30分钟,再分次加buff 10ml并研磨10分钟,, 研磨时间大约60分钟。转入50mL离心管,12000r/min离心10分钟,取上清液,并量取体积,留1.0ml 上清液(定为第一步骤的样品Ⅰ),用于测定酶活力和蛋白浓度。Р10
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