蔗糖合成酶的测定方法

7.5 )缓冲液,包括 50mmol/L MgCI 2; 2mmol/LEDTA ; 0.2%(W/V)BSA ; 2%PVP ; 0.1% 间苯二酚:称取 0.1g 溶解并定溶于 100ml 95% 乙醇中。 30% 盐酸、 2mol/L NaOH 、 100mmol/L UDPG 、 100mmol/L6- 磷酸果糖、 100mmol/L 果糖三、操作方法 1 、粗酶液制备称取 0.5g 样品( 植物叶片去掉主叶脉), 洗净剪碎, 置于预冷的研钵中,加 3ml Hepes-NaO H 缓冲液,冰浴研磨, 10000 ×g 离心 10min 。 2 、酶活性测定依次加入 50μL 粗酶液, 50μ LHepes-NaOH 缓冲液 pH7.5 , 20μL 50 mmol/LMgCI 2, 20μL 100mmol/L UDPG , 20μL 100mmol/L6- 磷酸果糖( 20μL 100mmol/L 果糖), 30℃中反应 30min 后,加入 200 μL 2mol/L NaOH 终止反应,沸水煮 10min ,流水冷却,加入 1.5ml 30% 盐酸和 0.5ml 0.1% 间苯二酚,摇匀后置于 80℃水浴保温 10min ,冷却后置于 480nm 处,以提前杀死酶活性为空白比色测定蔗糖含量。同时取 50μL 粗酶液,加入 200 μL 2mol/L NaOH ,以下同上操作,测定蔗糖含量。 3 、蔗糖标线制作: 取0、 40、 80、 120 、 160 、 200 μ g/ml 的蔗糖溶液 50μL ,操作同上,然后以蔗糖浓度为纵坐标,以吸光值为横坐标,得方程。 4 、计算样品中酶活性( μg·g ﹣1·h ﹣1)= 式中 C—反应液催化产生的蔗糖总量( μg ); V 1—提取酶液时加入的缓冲液体积( ml ); V 2—酶反应时加入的粗酶液体积( ml)