然后 15000 rpm 离心 4 度即可 ELISA protocol ;原位双膜法快速检测阳性表达株用 BMMY 培养基一般表达 1-2 天收集表达上清,稀释一定比例铺板做 ELISA 检测 1.取5- 10ul BMMY 表达上清用 0.05M NaHCO3 稀释到 100ul 铺 ELISA 板, 37 度或室温振荡大于1 小时。注意一定要做一个 GS115 空菌株表达上清作为阴性对照,最好还找一个带有 histag 的蛋白作为阳性对照。 2.TPBS 洗板 3 次,方法:倒掉铺板液,倒置于毛巾上轻轻拍打几次,加 TPBS 至满,重复。 3. 加封闭液( TPBS 加1 %脱脂奶粉) 350ml/ 孔, 室温下放置 40 分钟- 1 小时, TPBS 洗3次。 4. 加封闭液稀释的 histag 一抗 100ul/ 孔, ELISA 板于室温振荡 0.5 -1 小时, TPBS 洗3次。很多公司都有 histag 的单抗, 个人觉得 Qiagen 和 Pharmacia 单抗较好, Invitrogen 和 Labvisio n 的一般般,一般 1: 1000 - 5000 稀释,不同公司的抗体效价不同。 5. 加封闭液稀释的 HRP 标记的羊抗鼠二抗 100ul/ 孔, ELISA 板于室温振荡 0.5 -1 小时, TPB S 洗3次。二抗很多公司有, 国产的华美都可以,1: 500 - 1000 。如果是 HRP 标记的 hista g 抗体,不加二抗直接显色。 6. 加入 OPD 显色液 100ul/ 孔, 避光反应约 10- 30 分钟。显色液配方: 1mg/ml OPD 于 0.1M 柠檬酸钠, PH5.5 , 0.1%H2O2 ,- 20 度避光保存。也可以用 DAB 显色。 7.1M H2SO4 100ul/ 孔终止反应,酶标仪测 OD490nm 。
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