实验二、转座子随机突变及目标表型的筛选

实验内容Р♣染色体步移法克隆已知序列的侧翼序列?♣转座子随机突变及目的表型的筛选?♣大肠杆菌β-半乳糖苷酶的诱导?♣利用SDS-PAGE分析融合蛋白的可溶性?♣绿色糖单胞菌的发酵及孢外酶的提取Р转座子随机突变及目的表型的筛选?李丽萍Р实验目的Р1.了解细菌常见转座子Tn5的结构及转座机理?2. 学习利用转座子进行随机插入突变的实验过程?3. 掌握双亲接合实验的原理及过程Р实验原理Р转座子:?转座因子或跳跃因子,它可以从遗传物质的一部分跳跃到另一部分,从而引起遗传变异。?转座子的发现:?20世纪50年代初期,lintock 通过对玉米籽粒色斑不稳定现象的研究而发现转座现象,首次发现了能在基因组内不同区域转移的控制成分。Р实验原理Р细菌转座子的类型:?插入序列(Insertion sequence);?复合转座子(Composite transposons); Tn5?TnA 转座子家族(TnA family);?可移动噬菌体(Mu phage).Р实验原理РTn5:发现于E.coli,序列全长5818bp。?核心序列:编码三个抗生素(新霉素、博莱霉素、链霉素);? 两个倒置的IS50:IS50R编码53KD的Tnp和48KD的转座阻遏蛋白(Inh),两者使用同一阅读框,但启动子不同。IS50L的第1442碱基处存在一个赭石突变,IS50具有19bp的倒置末端,二者有7个碱基不相同,是转座酶(Tnp)的作用位点。Рkanr strr bleorРOE IE IE OEРIS50L IS50RРP1 (Tnp)?P2 (Inh)РP3?P4Р突变位点(Mutation site)РTn5的转座机理Р实验原理