71 菌株的 AOX1 位点彼 ARG4 基因插入, 而即甲醇利用缓慢型,两种菌株都适用于一般的酵母转化方法。多拷贝表达菌株的获得方式: 与自主复制的质粒型表达载体不同,整合型表达载体的拷贝数可以有很大的变化。含多拷贝外源基因的表达菌株合成蛋白的量也较多。体内整合可通过高遗传霉素抗性,筛选可能的多拷贝插入;而体外整合可通过连接产生外源基因的串联插入。多拷贝表达菌株的获得方式有两种:一种是利用 SDS-PAGE 电泳、免疫杂交或菌落点杂交方法在大量的转化子中进行自然筛选。得到产量高的表达菌株。另一种在转化前将多个表达盒拷贝插入到单个载体中,而后再通过交换整合到受体染色体上。表达蛋白纯化方法: 酵母系统表达的蛋白一般都具有活性,所以都采用较温和的纯化方式来纯化目的蛋白,分泌型表达的蛋白有利于纯化,可用硫酸铵沉淀,然后用离子交换,凝胶过滤层析,疏水层析等方法进一步纯化。具体的方法和操作应按所处理的目的蛋白的性质选择。Р毕赤酵母利用的优缺点分析Р Pichia.pastoris酵母菌体内无天然质粒,所以表达载体需与宿主染色体发生同源重组,将外源基因表达框架整合于染色体中以实现外源基因的表达。包括启动子、外源基因克隆位点、终止序列、筛选标记等。表达载体都是穿梭质粒,先在大肠杆菌复制扩增,然后被导入宿主酵母细胞。为使产物分泌胞外,表达载体还需带有信号肽序列。Р甲醇营养型毕赤酵母优点: (1)具有醇氧化酶AOX1基因启动子,这是目前最强,调控机理最严格的启动子之一; (2)表达效率高,其表达的外源蛋白可占总表达蛋白的90%以上,有利于目的蛋白的分离纯化;(3)在简单合成培养基中可实现高密度培养; Р(4)表达质粒能在基因组的特定位点以单拷贝或多拷贝的形式稳定整合; Р(5)由于该酵母可以以甲醇为唯一的碳源和能源,而绝大多数微生物并不能以甲醇为碳源,可以减少污染。甲醇营养型毕赤酵不足之处:
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