依细胞种类而异。3、用试管塞塞住试管,配平,800rpm 离心3min,去除上清液,加入适量完全培养液,使细胞浓度为1~5×106cells/ml,混合均匀。4、吸取16滴细胞悬液到冻存管中,再加入2滴FBS,2滴DMSO(二甲基亚砜,为细胞冻存保护剂),使FBS浓度为20%,DMSO浓度为10%。盖紧冻存管盖,在壁上标记好冻存细胞名称、冻存年月日。5、把冻存管放到-70℃冰箱程序降温盒中24小时(勿超过1周),然后转移到-196℃液氮罐中长期保存。 注意:(1) 注意冷冻保护剂之品质。DMSO应为试剂级等级,无菌且无色(以0.22micron FGLP Telflon过滤或是直接购买无菌产品,如SigmaD-2650),以5~10ml小体积分装,4℃避光保存,勿作多次解冻。(2)冷冻保存之细胞浓度:①normalhumanfibroblast:1~3×106cells/ml②hybridoma:1~3×106cells/ml,细胞浓度不要太高,某些hybridoma会因冷冻浓度太高而在解冻24小时后死去。③adherenttumorlines:5~7×106,依细胞种类而异。Adenocarcinoma解冻后须较高之浓度,而HeLa只需1~3×106cells/ml④othersuspensions:5~10×106cells/ml,humanlymphocyte须至少5×106cells/ml。(3)冷冻保护剂浓度为5或10%DMSO,若是不确定细胞之冷冻条件,在做冷冻保存之同时,亦应作一个backupculture,以防止冷冻失败。(4)DMSO(二甲基亚砜)在常温下对细胞毒性较大,而在4℃时,其毒性大大减弱,且能以较快的速度渗透到细胞内,故冻存细胞时使用室温下的DMSO,在冻存的细胞复温后,应及时洗涤冷冻保护剂DMSO(离心后弃去上清),防止DMSO对细胞产生毒性。
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