糖层较薄、交联度低,故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质,增加了细胞壁的通透性,使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出,结果细菌就被脱色,再经蕃红复染后就成红色。G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高,类脂质含量少,经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小,通透性降低,因此细菌仍保留初染时的颜色。Р四、实验内容Р1、涂片:取干净载玻片一块,在载玻片的中央加一滴蒸馏水,用接种环以无菌操作法取少量菌苔于水滴中,混匀并涂成薄膜。注意取菌不要太多;涂片要均匀,不易过厚。Р2、干燥:让涂片自然晾干或者在酒精灯火焰上方文火烘干。Р3、固定:手执玻片一端,有菌面朝上,迅速通过火焰2~3次固定(以薄片背面不烫手为宜,以免破坏细胞形态),热固定的目的是使细菌细胞质凝固,以固定细胞形态,并使之牢固附着在载玻片上。Р4、初染:滴加适量(以盖满细菌涂面为宜)结晶紫染色液染色1分钟,倾去染色液,用水小心地冲洗。Р5、媒染:滴加碘液,媒染1min,水洗,用滤纸吸干残存的水。Р6、脱色:将玻片倾斜,连续滴加95%乙醇脱色20~25s至流出的乙醇无色,立即水洗。Р7、复染:滴加蕃红染液复染2~3min,水洗。Р8、镜检:将染好的涂片放空气中晾干或者用吸水纸吸干,先低倍观察,再高倍观察和油镜观察。Р五、注意事项Р1、革兰氏染色成败的关键是酒精脱色。如脱色过度,革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性菌;如脱色时间过短,革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性菌。脱色时间的长短还受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影响,难以严格规定。Р2、染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后,应吸去玻片上的残水,以免染色液被稀释而影响染色效果。Р3、选用幼龄的细菌,若菌龄太老,由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。Р六、思考题Р1、简述菌株革兰氏染色后的观察结果(形态、颜色、革兰氏染色反映)。Р2、分析你的染色结果是否正确?如果不正确,请说明原因。
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