录按标签找到所需细胞的编号。Р 2.从液氮罐中取出细胞盒,取出所需的细胞,同时核对管外的编号。Р 迅速解冻:Р 1.迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻,并要不断的摇动,使管中的液体迅速融化。Р 2.约1-2min后冻存管内液体完全溶解,取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁,再拿入超净台内。Р 平衡离心:Р 用架盘天平平衡后,放入离心机中3000r/min 离心3minР 制备细胞悬液:Р 1.吸弃上清液。Р 2.向离心管内加入10ml培养液,吹打制成细胞悬液。Р 细胞计数:Р 细胞浓度以5×105/ml为宜。Р 培养细胞Р 将复合细胞计数要求的细胞悬液分装入培养瓶内,将培养瓶放入Р37℃和5%CO2的培养箱内2-4小时(或者24-48小时)后换液继续培养培养,换液的时间由细胞情况而定。初学者易犯错误:Р 1水浴锅未预热或者未预热到37℃。Р 2.水浴锅内冻存管太多,导致传热不佳,使融化时间延长。Р 3.离心前忘记平衡,导致离心机损坏和细胞丢失。Р 4.一次复苏细胞过多,忘记更换吸头和吸管,导致细胞交叉污染。Р 六、细胞计数Р 实验原理:当待测细胞悬液中细胞均匀分布时,通过测定一定体积悬液中的细胞的数目,即可换算出每毫升细胞悬液中细胞的细胞数目。Р 具体操作:Р 准备工作:Р 取一瓶传代的细胞,按照《传代细胞培养(消化法)》中的传代方法繁殖细胞,待长成单层后以被使用。Р 细胞悬液制备:Р 细胞悬液的制备方法是用0.25%的胰蛋白酶液消化、PBS液洗涤后,加入培养液(或Hanks液或PBS等平衡盐溶液),吹打制成待测细胞悬液。Р 细胞计数:Р 1.盖好盖玻片:取一套血球计数板,将特制的盖玻片盖在血球计数槽上。Р 2.制备计数用的细胞悬液:用吸管吸5滴细胞悬液到一离心管中,加入5滴台盼蓝染液(0.4%)或苯胺黑,活细胞不会被染色,加入染液后就可以在显微镜下区别活细胞和死细胞。
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