旋紧冻存管盖子;Р (4) 静置30分钟,使冻存液和细胞内的DMSO浓度达到平衡;Р (5) 将冻存管置于程序降温仪内,设置降温速率1℃/min,-40℃后5℃/min,降温至-Р 100℃停止;Р (6) 将冻存管置于液氮罐(-196℃),长期保存。Р 2. 复苏过程Р (1) 准备好玻璃方瓶、移液管、离心管等(无菌),新鲜培养基;Р (2) 将冻存管从液氮罐中取出,立即置于40℃水浴中,直至冻存管内细胞悬浮液完全融Р 解,此过程约1-2分钟;Р (3) 在超净工作台内将冻存管内细胞悬浮液移至离心管,加入Р10ml新鲜培养基,离心Р (5min,1500rpm);Р 倒掉上清液,将细胞重新悬浮于10ml新鲜培养基中,移至玻璃方瓶,置于二氧化碳培养箱。Р 五、实验讨论Р 因为冷冻和复苏的实验没有相关需要记录的数据,所以本部分跳过了实验结果这一节,直接进行讨论。这两次实验的注意事项为:Р 1. 涉及和液氮相关的操作,应戴好防护手套以防冻伤;Р 2. 冻存管盖子必须旋紧,否则液氮容易渗入冻存管内,这样不仅可能导致污染,而且Р 将严重损伤细胞。Р 可能由于老师考虑到实验过程中的危险性,并没有让我们进行有关于液氮的实验操作步骤,但这两项注意还是值得我思考和借鉴的。这两次实验的重点是冷冻过程中温度必须缓慢下降,尽可能减少细胞内冰晶的形成;在复苏过程中采用快速解冻,减少解冻过程所形成的局部渗透压波动对细胞产生伤害。如不注意这两点,会对细胞冻存和复苏后细胞的存活率带来影响。Р 其实这两次实验的主要内容基本都与垂直超净工作台有关,个人认为老师的用意也是在此,让我们了解实验室中动物细胞不论用在何处,无菌首先是第一位的,因为要考虑到动物细胞的生长周期较长,所以保持无菌操作的必要性就变得尤为重要。Р 最后,感谢老师提供的讲义,让我们省下不少寻找资料和预习实验的时间,也同时感谢老师一个星期的指导。
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