浓度,记好A260、Con(ug/ml)和A260/A280,原始浓度为测量浓度*50(A260和Con换算为Con:A260=40,A260/A280为1.6-2.0,线性范围最好),标化的方法是以最低浓度的一个样品为标准进行标化,标化10ulRNA,计算各个样品加DEPC水量,做RT时RNA加样量为X(0.5ug/原始浓度*1000)ul。RT-PCR材料:逆转录试剂盒(TAKARADRR047A)、PCR试剂盒(TAKARADRR081A)PCR水(灭菌蒸馏水)、去RNA酶的200ul离心管、PCR8连管、计时器、水浴箱逆转录反应体系为20ul(1)基因组DNA的除去反应。5*gDNAEraserBuffer2ulgDNAEraser1ulRNaseFreedH2O(10-2-1-X)ulTotalRNAXul42℃2min水浴,4℃保存(2)反转录反应。5*PrimeScriptBuffer24ulPrimerScriptRTEnzymeMIX11ulRTPrimerMIX41ulRNaseFreedH2O4ul37℃15min→→85℃5sec(PCR仪反应,约16min,迅速转入-20℃保存)PCR反应体系为25ulSYBRPremixEXTaqⅡ12.5ul上游引物0.25ul下游引物0.25ulPCR水10ulcDNA2ul*无论做RT还是PCR应先将按样品数计算每种试剂加入量,配在一管里面混匀后加入每个反应管里面,再加各个管的RNA或cDNA,为了保证每管加量完全,可以多配1-2样品的试剂量,混匀加入每管。*考虑到做PCR时检测具体基因数不同,反应体系可以以倍数的改变,如P两个基因,RT时可以做6ul体系,即每个试剂加入量均*0.3,混匀后加入每管。*加入RT后cDNA2ul,注意加样量一致,改好盖子,在盖子一端的边缘做好标记,弹去反应液里面的空气,离心。
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