TA基因克隆的技术要点ppt

组质粒的转化及阳性克隆的鉴定? 1. 大肠杆菌感受态细胞的制备? 2. 重组DNA的转化? 3. 重组质粒的鉴定РT-A克隆РT-A克隆方法(Original TA Cloning Kit)? 是把5’-A突出的PCR片断与一个具有3’-T突出的载体DNA连接起来的方法。РPCR反应中所适用的聚合酶具有末端转移的活性,通常在5’加上A。只有用经过特殊处理的具有3’-T突出末端的DNA片断才能通过T/A配对进行连接。Р比平头连接效率高50~100倍。Р3’-A突出的PCR产物Р使用不同的Taq酶,在PCR扩增循环结束后,加上72℃10分钟一个过程,Taq酶可以在扩增产物的3末端加上A 。Р使用高保真的DNA聚合酶,如pfu酶,其不能在扩增产物的3末端加上A,得到的DNA序列为钝端,因此,在回收纯化后进行加A的过程,通常是以PCR回收产物为模板,加上一定量的普通Taq酶和反应液,加入dATP(或dNTP), 72℃ 10分钟。РT载体Р一般采用的方法是先把载体用某种限制性内切酶消化成平头,再在70℃或72℃下在只加入dTTP的反应体系中用Taq DNA聚合酶处理半小时(也有人报道处理1~2小时能提高克隆效率,这样加T反应会更彻底)。也可以用末端转移酶来完成加T反应。载体自连、PCR产物串连可以忽略。?如果使用ddTTP,效果会更好。РT载体РpMD 18-T Vector? 是一种高效克隆PCR产物(TA Cloning)的专用载体。?它由pUC18载体改建而成。在pUC18载体的多克隆位点处的Xba I 和Sal I识别位点之间插入了EcoR V 识别位点,用 EcoR V进行酶切反应后,再在两侧的3‘端添加“T”而成。РpUCm-T ?由pUC-19改建而成。РpUC18载体РpMD18-T VectorРpUCm-TРpUCm-T的多克隆位点РPCR克隆目的基因的基本程序