培养基表面,平板倒置放在37℃培养箱中培养过夜。4.1.1.2菌种的活化用无菌牙签挑取平板上的菌落,接种于于5mlLB含氨卞青霉素(0.1g/ml)的液体培养基内,37℃,250rpm,恒温摇床振荡增殖培养过夜。4.1.1.3细菌的收集用微量移液枪取2mL菌液至2mlEP管内,6000rpm离心3min,弃尽上清液。4.1.1.3细菌的裂解向沉淀中加入200μL预冷的碱裂解液Ⅰ中,强烈振荡混匀(用移液枪吹打),加入400μL碱裂解液Ⅱ,盖严管盖,轻轻颠倒混匀4-5次,冰浴5min,加入300μL预冷的溶液Ⅲ,温和振荡数次,冰浴5min,10000rpm室温离心5min,取上清至一个新的无菌的1.5mLEP管中。4.1.1.4提取质粒向上述上清中加入等体积酚氯仿(1:1),振荡混匀,10000rpm离心5min,上清转移至另一个EP管中。4.1.1.5质粒纯化将酚氯仿的混合物换成等体积的氯仿,重复3、4两个步骤。向上清中加入等体积异丙醇,轻轻震荡混匀,室温静置3min,10000rpm离心10min,倒去并用吸水纸洗干上清液,加入70%乙醇,盖紧管口,颠倒几次,10000rpm离心2min,弃去上清液,在50℃烘箱中烘干至沉淀变透明。4.1.1.6纯化质粒DNA向质粒中加入20μL蒸馏水,并加入1μL的RNA消化酶数分钟,-20℃冰箱保存备用。4.2质粒DNA电泳检测4.2.1琼脂糖凝胶电泳(1%)制备称取琼脂糖0.5g放入三角瓶,加50ml电泳缓冲液,在电炉上充分加热溶解后滴加一小滴EB(溴化乙锭)溶液,使溶胶成微红色,摇匀。在室温下冷却至65℃左右,向放好梳子和挡板的槽内到胶,厚度约0.3cm左右。待胶体凝固后,小心拔出梳子,将电泳胶放到电泳槽的平台上,加电泳缓冲液使其刚好浸没胶面。4.2.2电泳取获得的质粒DNA5μL与1μL含溴酚蓝指示剂的上样缓冲液,混匀后上样电泳。
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