液器、电泳槽、电泳仪、振荡器、制冰机、蓝盾可见光透射仪、凝胶成像仪3.3试剂BamHI(10U/μL)(TaKaRa公司);NotI(10U/μL)(TaKaRa公司),T4ligase4.操作步骤4.1酶切按如下双酶切体系(30μL)混合:反应物(μL)pEGFP-N3pET-28a质粒1818BamHI22NotI2210×bufferK330.1%BSA缓冲液33离心10s,混匀。37℃水浴酶切3-4h。配制1.0%(M/V)普通琼脂糖凝胶30ml。适当放置冷却,45℃左右倒于电泳胶板上,插好梳子。待凝胶凝固好以后,拨下梳子。酶切样品中加入5µl溴酚蓝-GeneFinder混合液混匀,上样。1×TBEBuffer,80V(3-4V/cm)下电泳30min。荧光激发器观察质粒DNA条带的酶切情况,并照像。4.2回收酶切产物(采用天为时代DNA回收试剂盒进行回收)配30mL1%进口琼脂糖凝胶,尽量长一些(用粗梳子),对酶切产物进行电泳分离;将酶切产物全部加入加样孔中跑胶,观察结果,并且拍照。用干净的刀片将需要的DNA条带从凝胶上切下来,称取重量。以0.1g凝胶对应300μL的体积加入PN。50℃水浴放置10min,期间不断温和上下翻动离心管至胶完全融解。将上一步得到的溶液加入到一个吸附柱中,吸附柱再放入收集管,13000rpm离心60s,弃掉废液。加入800μL漂洗液PW,13000rpm离心60s,弃掉废液。加入500μL漂洗液PW,13000rpm离心60s,弃掉废液。将离心吸附柱放回收集管,13000rpm离心2min。取出吸附柱,放入一个干净的离心管中,在吸附膜的中间位置加入适量洗脱缓冲液EB30μL,洗脱缓冲液先在65℃水浴预热,室温放置2min,13000rpm离心1min,然后将离心的溶液重新加回离心吸附柱中,13000rpm离心1min。置于-20℃保存。
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