复制的原理,以待扩增的DNA为模板,在体外由引物介导的酶促合成特异DNA片段。PCR扩增经变性、退火和延伸若干个循环后,DNA扩增2n倍。PCR具体过程模板DNA的高温变性:模板DNA经加热至94℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链的氢键断裂,DNA解离成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备;模板DNA与引物的低温退火(复性):模板DNA经加热变性成单链后,使PCR反应体系温度降至50-60℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合引物的适温延伸:DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链,重复循环变性-退火-延伸三过程,就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2~4分钟,2~3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。上述3步为一个循环,即高温变性、低温退火、中温延伸3个阶段。从理论上讲,每经过一个循环,样本中的DNA量应该增加一倍,新形成的链又可成为新一轮循环的模板,经过30个循环后,理论上可使DNA扩增至10亿(230=109)倍。PCR的反应动力学:PCR的三个反应步骤反复进行,使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA扩增量可用Y=(1+X)n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数,X表示平(Y)均每次的扩增效率,n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%,但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期,靶序列DNA片段的增加呈指数形式,随着PCR产物的逐渐积累,被扩增的DNA片段不再呈指数增加,而进入线性增长期或静止期,即出现“停滞效应”,这种效应称平台期数、PCR扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。大多数情况下,平台期的到来是不可避免的。
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