蛋白表达纯化0419资料讲解

解性在E.coli中表达的重组蛋白经常以不溶的、无活性蛋白聚集体的形式表达,被称作包涵体。即使在形成包涵体时,还是有一部分目的蛋白是溶解的。由于pET系统的高表达水平,即使有大量的目的蛋白聚集形成包涵体,也会有相当多的可溶性目的蛋白存在。在通常情况下,降低蛋白合成速率,如降低诱导培养温度及在基本培养基中生长都会使目的蛋白的可溶性增加。诱导和培养条件:37℃(包涵体),30℃,低温(15-20℃)诱导过夜,IPTG浓度,诱导后的培养条件细胞周质定位:选择带有信号肽的载体(pET12/20/22)宿主菌:尝试可表达真核蛋白的Rosseta菌株裂解缓冲液:普通的Bindingbuffer中一些疏水或膜结构蛋白会是不溶的,但如果加入非离子去污剂就会变成可溶。表达载体选择标签选择:6XHis:--适合任何表达系统--纯化后不需切割标签--纯化简单,也可纯化包涵体蛋白--小标签对重组蛋白折叠影响小GST:谷胱甘肽巯基转移酶--适合任何表达系统--相对可增加蛋白的可溶性--纯化后需切除标签--标签蛋白可能会形成二聚体标签蛋白:优点--可以提高蛋白的可溶性和稳定性。--用亲和层析的方法对蛋白进行纯化,采用通用的检测标签的方法。缺点--标签可能对蛋白的结构、折叠和生物学活性有影响。--切除标签时,酶切效率不会达到100%,会有氨基酸残余。His标签:pET系列常规表达载体:pET28a、pET32a、pQE系列周质腔表达载体:CBD融合(pET36/37)、Dsb融合(pET39/40)采用带pelB/ompT引导肽的载体(pET12/20/22)采用带MBD融合(pMAL载体,Biolabs)、SUMO融合GST标签:pGEX系列pET-28a蛋白纯化蛋白纯化方法--亲和层析--凝胶过滤--离子交换层析亲和层析—通过生物分子之间特异性的相互作用来分离物质的方法。配体—受体抗原—抗体底物—酶