A导入细胞膜内。带正电的阳离子脂质体则不同,DNA并没有预先包埋在脂质体中,而是带负电的DNA自动结合到带正电的脂质体上,形成DNA-阳离子脂质体复合物,从而吸附到带负电的细胞膜表面,经过内吞被导入细胞。脂质体法始于1987年,此法的出现使得转染效率、转染的稳定性和可重复性大大提高。阳离子脂质体细胞毒性相对较高,对不同的细胞可能会干扰细胞的代谢。Р非脂质体的脂质:新一代的脂质体技术,其与DNA结合形成胶束结构而非简单的双层膜结构,使DNA的传递更有效且细胞毒性明显降低。Р活化的树状聚合物:该聚合物的高度树状分枝形成球形结构,借助每个球体无数活化的氨基末端凝聚在DNA上形成较为致密的结构,并吸附在细胞膜上,经内吞进入细胞。活化的氨基可以调节胞内溶酶体pH值,抑制降解活性,使DNA稳定存在。转染效率高,毒性低,可重复性好。血清的存在能显著提高转染效率。РCHO细胞的筛选方法Р挑选高表达的单克隆细胞株一般采用两种流程:第一种方案首先通过检测外源基因的表达,逐一筛选dhfr阳性单克隆,再转到浓度持续升高的MTX之下生长,分别进行扩增;另一种方法先把dhfr阳性单克隆合并,在不断升高的MTX之下加压扩增外源基因的表达,最后挑出稳定的、高表达的单克隆细胞株。加压扩增外源基因表达,除了单纯使用dhfr扩增系统或GS扩增系统外,也可采用G418与MTX联合作用细胞,G418与MSX(methioninesulphoximine,GS抑制物)联合作用细胞,或者利用dhfr扩增系统与GS扩增系统共加压。混合克隆的表达水平远赶不上表达较高的单个克隆,这是因为转染的CHO细胞中存在不表达或低表达的非生产细胞,并可在长期生存,甚至MTX加压时占生长优势,排斥其它高表达细胞,成为细胞群体中的主要部分,导致产量严重下降,并对MTX加压无反应。当撤除MTX,会发生外源蛋白表达量下降的情况,原因也可能在此。
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