法?(4)子房注射法?(5)花粉管通道法?(6)聚乙二醇法?(7)电击法?(8)脂质体法?(9)磷酸钙-DNA共沉淀法Р以外植体为受体Р以种质系统为受体Р以原生质体为受体Р子房注射法?原理:使用微注射针或显微注射仪将外源DNA注入处于减数分裂期的受体植物的子房中,借助子房产生的压力和卵细胞产生的吸收力,外源DNA进入受精的卵细胞中,借助合子胚旺盛分裂过程中基因组的复制、重组、缺失或易位等现象,外源DNA被随机整合到受体染色体上。Р磷酸钙-DNA共沉淀法:?原理:由于核酸以磷酸钙-DNA共沉淀物的形式存在,培养细胞对DNA的吸收会大大提高,细胞通过内吞作用,使DNA进入细胞质,并转移整合到细胞核内的染色体内。Р方法:一般是将DNA与CaCl2 溶液混合后,同时加入HEPES缓冲的盐溶液(HeBS)混合,静置后形成DNA-磷酸钙沉淀物,然后用来转染受体细胞。这个过程中,pH值、Ca 2+浓度等都会对转染的效率有所影响。方法简单,效率较高,可达培养细胞的20%。Р基因转移的方法Р应用于动物的基因转移方法:?(1)显微注射法?(2)逆转录病毒介导法?(3)胚胎干细胞法?(4)精子载体法?(5)细胞核移植法?(6)生殖细胞转染法Р培养过程中利用标记基因筛选Р标记基因Р选择标记基因(Slective gene)Р报告基因(Report gene)Р抗生素类选择基因?抗除草剂类选择基因?……Рβ-D-葡萄糖酸苷酶基因(Gus)?荧光素酶基因(Luc)?绿色荧光蛋白基因(Gfp)?……Р转基因生物的筛选与鉴定Рβ-D-葡萄糖酸苷酶基因(Gus):?β-D-葡萄糖酸苷酶催化β-葡萄糖苷酯类物质水解。其中很多水解产物具有发色团或形成荧光物质。?例:组织化学法测定Gus活性? 作用底物为X-gluc,产物是一种不可溶的5,5-二溴,4,4-二氯靛蓝;РpAF30载体Р线虫AD模型(CL4176)
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