细胞的转录因子中大约有一半含有锌指结构,ZFN是将锌指蛋白与核酸内切酶FokI融合形成的核酸内切酶,利用它可以在各种复杂基因组的特定位置制造DNA的双链切口。第二代人工核酸内切酶:类转录激活因子效应物核酸酶(transcriptionactivator-likeeffectornuclease,TALEN)的出现在很大程度上替代了ZFN。TALEN可以和ZFN一样对复杂的基因组进行精细的修饰,同时其构建较为简单,特异性更高,因此受到了科研工作者的青睐。2012年,TALEN被《科学》杂志评为十大科学突破之一。第三代人工核酸内切酶:规律间隔成簇短回文重复序列-Cas蛋白(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats(CRISPR)/CRISPR-associated(Cas)9),主要是基于细菌的一种获得性免疫系统改造而成,其特点是制作简单、成本低、作用高效。图B:锌指核酸酶二聚体与 DNA结合示意图。锌指核酸酶的靶序列含有两个锌指蛋白结合位点,不过这两个位点之间还有一段5~7bp的间隔序列,锌指核酸酶里的Fok I酶切结构域就能够切割这段间隔序列。当然,我们也可以设计出只能够识别左侧或者右侧结合位点的锌指蛋白。ZFN:Cys2–His2锌指蛋白图A:一个锌指大约由30个氨基酸组成,形成了一种保守的ββɑ结构。在锌指ɑ螺旋结构表面的那几个氨基酸能够与DNA大沟上的3个碱基结合,不过这种结合的选择性会有所差异。因为有了高度保守的链接序列,我们就可以设计出能够识别9~18个碱基长度的DNA序列。在一段 680亿个碱基组成的DNA序列里,18个碱基组成的序列就足以成为一段特异性的序列,所以如果能够设计出含有3种以上的锌指蛋白DNA识别结构域的蛋白,那么就意味着科学家们能够利用锌指蛋白识别出人类基因组里的任意一段DNA序列。
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