一缓冲液,在同一体系中加入逆转录酶、引物、Taq酶、4种dNTP 直接进行mRNA反转录与PCR扩增。发现Taq酶不仅具有DNA多聚酶的作用,而且具有反转录酶活性,可利用其双重作用在同一体系中直接以mRNA为模板进行反转录和其后PCR扩增,从而使mRNA的PCR步骤更为简化。所需样品量减少到最低限度,临床小样品的检测非常有利。用一步法扩增可检测出总RNA中小于1ng的低丰度mRNA。该法可用于低丰度mRNA的cDNA文库的构建及特异cDNA的克隆,并有可能与Taq酶的测序技术相组合,使得自动反转录、基因扩增与基因转录产物的测序在单管中进行。РRT-PCR—一步法和两步法Р两步法:由于单管反应时RT和PCR都不能在最佳条件下进行并且容易相互干扰,常只适宜用基因特异引物扩增较短的基因,及定量PCR。两步法则是将RT和PCR分别进行,这样使得两个反应充分发挥各自的特点,更为灵活而且严谨,适合那些GC含量、二级结构严重的模板或者是未知模板,以及多个基因的RT-PCR。РRT-PCR—一步法和两步法Р外源基因的转录表达Р基因表达Р基因表达指基因组中某基因在细胞中?转录为mRNA和翻译成蛋白质的过程。Р基因表达的改变预示着细胞在分子水平?上的变化。它往往是细胞形态功能变化之?前的变化。РDNAРRNAРProteinР转录Р翻译Р仪器? 旋涡混合器,微量移液取样器,移液器吸头,0.2ml PCR微量管,双面离心管架,PCR仪,台式离心机,琼脂糖凝胶电泳系统,水漂,恒温水浴。?试剂? RNA 反转录酶,3U/μL Taq DNA聚合酶,PCR缓冲液(10×,MgCl2 free),25mM MgCl2,dNTP,引物,模板质粒pMD18-T-NK,无菌dd water。Р实验操作步骤:Р1)RNA提取:? 关键防止RNA降解РRNA提取的成功与否?是RT-PCR检测中最?重要的步骤。
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