荧光原位杂交技术

0%,80%,100%乙醇系列脱水,每级5分钟?2、胃蛋白酶处理? 1) 0.005-0.02% pepsin(10 mM HCl) 37℃处理10 min? 2) 1×PBS洗2×5min? 3) 1×PBS,50 mM MgCl2处理5min? 4) 1×PBS,50 mM MgCl2,1%甲醛固定10min? 5) PBS洗涤并脱水,气干Р非放射性标记法Р直接法?荧光素(fluorescein)或其他荧光染料? 间接法?地高辛(digoxigenin)?生物素(biotin)Р1. 随机引物法?2. 缺口平移法?3. PCR法?4. 寡核苷酸末端标记法?5. 直接在探针3’或5’端合成Р1. 0.5ml离心管中加入1ug探针DNA,加水置体系为16ul?2. 沸水浴中变性10min, 马上置于冰水中?3. 加入4ul DIG-High Prime(5x buffer; 50% glycerol;1 U/μl Klenow enzyme; 5x random primer mix; 1 mM each of dATP, dCTP, and dGTP; 0.65 mM dTTP; and 0.35 mM DIG-11-dUTP) ?4. 混匀离心,置于37℃温育1小时~20小时?5. 65 ℃处理10min终止反应Р染色体标本变性Р共变性?杂交液加到标本上封片,置80 ℃烘箱中10分钟?分别变性?70%甲酰胺,2xSSC 70 ℃处理2分钟?70%,85%,100%冷乙醇系列脱水,空气干燥Р1. 杂交液(50% 去离子甲酰胺, 2x SSC, 10% 硫酸葡聚糖, 50 mM 磷酸钠; pH 7)中加入标记的探针,每10ul杂交液含50ng探针?2. 探针95 ℃变性5分钟,置冰水中10分钟?3. 10ul杂交液加到标本上,盖盖玻片并封片?4. 湿盒中37℃杂交过夜Р杂交