玻片放入预温至 72 ℃( 每增加一张玻片, 温度要提高 1℃)的 70 % 去离子甲酰胺/2× SSC 中变性 2 分钟后,立即置入预冷至-20 ℃保存的梯度乙醇脱水晾干。 2.4 蛋白酶消化将 50 μl 100 mg/ml 的胃蛋白酶( 终浓度为 0.01 %) 加入预温至 37 ℃的 50ml 蒸馏水( PH 2.0 , 以适量稀盐酸酸化)中, 混匀; 将变性后的玻片放入其中处理 10 分钟; 室温下 1× PBS 中振荡洗涤, 5min/ 次×2 次;室温下梯度乙醇脱水后凉干。注:靶 DNA 的变性和消化应与探针变性同步进行,完成后尽快进行杂交。 3. 杂交将变性后的 DNA 探针加于玻片杂交区域,盖上 22mm × 22mm 盖玻片,封片后置于湿盒中, 37 ℃杂交过夜。第三天 1. 杂交后洗涤和半抗原信号放大 1.1 杂交后洗片小心揭去封片胶和盖玻片,将玻片置于预热至 46 ℃的 50 %甲酰胺/2× SSC 中, 5min ×3 缸;将玻片移入室温下 4× SSC/0.1 % Tween-20 中振荡洗涤 5min ×2 缸;每张玻片滴加 30 μl 阻断液 1 ,盖上 22mm × 22mm 盖玻片,于 37 ℃湿盒中孵育 30min ;再次将玻片移入室温下 4× SSC/0.1 % Tween-2 0 中振荡洗涤 5min ×2 缸。注:此后步骤应注意避光操作。 1.2 滴加一抗将4μl Anti-DIG monoclonal antibody 和 0.5 μl Texas-red-Avidin 稀释于 100 μl 抗体稀释液 1 中, 混匀;每张玻片滴加 25 μl 于杂交区域,盖上 22mm × 22mm 盖玻片,于 37 ℃湿盒中孵育 1 小时;室温下 4× SSC/0.1 % Tween-20 中振荡洗涤 5min ×2 缸。 1.3 滴加二抗
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