且不利于普及。РPCR技术:1985年由美国 Cetus 公司的Kary Mullis 首创,可以将微量目的DNA片段扩增一百万倍以上。Р优点:敏感度高、特异性强、产率高、重复性好以及快速简便等,广泛应用于微生物学、考古学、法医学及体育等领域,并已普及到许多普通实验室,大大简化了传统的分子克隆技术,从而比较容易地对目的基因进行分析、鉴定。? Kary Mullis 本人因此获1993年诺贝尔化学奖。Р二、PCR的原理:? 用于扩增位于两段已知序列之间的DNA片段,类似于天然DNA的复制过程。? 以拟扩增的DNA分子为模板,以一对分别与模板5′末端和3′末端互补的寡核苷酸片段为引物,在DNA聚合酶的作用下,按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成,重复这一过程,即可使目的DNA片段得到扩增。Р扩增的特异性取决于引物与模板DNA的特异结合,基本反应步骤分三步:?1. 变性(Denaturation):? 加热使模板DNA双链间的氢键断裂而形成两条单链。94℃ 30″?2. 退火(复性) (Annealling):? 突然降温后模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合,也存在两条模板链之间的结合,但由于引物的高浓度,结构简单的特点,主要的结合发生在模板与引物之间。55 ℃ 30 ″Р3. 延伸(Extension):? 将反应温度调节到酶的最适温度,在DNA聚合酶、4种 dNTPs 及镁离子等存在的条件下,以引物的 3′端开始,结合单核苷酸,形成与模板链互补的新DNA链。72 ℃ 1′? 上述 3 步为一个循环,每经过一个循环,样本中的DNA量应该增加一倍,新形成的链又可成为新一轮循环的模板,经过25~40个循环后DNA可扩增106 ~ 109 倍。РPCR 的基本反应步骤Р变性?95˚CР延伸?72˚CР退火?Tm-5˚CР94℃变性Р50-65℃退火Р72℃延伸
全文预览
