实时荧光定量PCR原理课件-课件【PPT讲稿】

要因素。变性后温度快速冷却至 40 40 ℃℃~ ~ 60 60 ℃℃,可使引物和模板发生结合。由于模,可使引物和模板发生结合。由于模板板 DNA DNA 比引物复杂得多,引物和模板之间的碰撞比引物复杂得多,引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间,取决于引物的长度、碱基组成及其温度与时间,取决于引物的长度、碱基组成及其浓度,还有靶基浓度,还有靶基因因序列的长序列的长度。度。温度与时间的具体分析温度与时间的具体分析??对于对于 20 20 个核苷酸, 个核苷酸, 55 55 ℃℃为选择最适退火温度的起为选择最适退火温度的起点较为理想。点较为理想。??复性温度复性温度= =解链温度解链温度-(5 -(5 ~ ~ 10 10 ℃℃) ) ??在解链温度允许范围内, 在解链温度允许范围内, 选择较高的复性温度可选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合,提高大大减少引物和模板间的非特异性结合,提高 PCR PCR 反应的特异性。复性时间一般为反应的特异性。复性时间一般为 30 30 ~ ~ 60sec 60sec , , 足以使引物与模板之间完全结合。足以使引物与模板之间完全结合。温度与时间的具体分析温度与时间的具体分析??③③延伸温度与时间: 延伸温度与时间: Taq DNA Taq DNA 聚合酶的生物学活聚合酶的生物学活性: 性: ?? 70 70 ~ ~ 80 80 ℃℃ 150 150 核苷酸核苷酸/S/ /S/ 酶分子酶分子?? 70 70 ℃℃ 60 60 核苷酸核苷酸/S/ /S/ 酶分子酶分子?? 55 55 ℃℃ 24 24 核苷酸核苷酸/S/ /S/ 酶分子酶分子??高于高于 90 90 ℃℃时, 时, DNA DNA 合成几乎不能进行。合成几乎不能进行。