扩增靶DNAРDouble strand cDNAРAAAAAРTTTTTРRTРAAAAAРTTTTTРRTРRTРAAAAAРTTTTTРOligo dT primer is bound to mRNAРReverse transcriptase (RT) copies first cDNA strandРReverse transcriptase digests and displaces mRNA and copies second strand of cDNAРRT-PCRРA. Double strand DNAРB. DenatureР96ºР50ºРC. Anneal primersР50ºРD. Polymerase bindsР72ºРTaqРTaqРRT-PCRРcDNA第二链的合成方法有以下几种: ? (1) 自身引导法合成的单链cDNA 3'端能够形成一短的发夹结构,这就为第二链的合成提供了现成的引物,当第一链合成反应产物的DNA:RNA杂交链变性后利用大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ Klenow片段或反转录酶合成cDNA第二链,最后用对单链特异性的S1核酸酶消化该环,即可进一步克隆。但自身引导合成法较难控制反应,而且用S1核酸酶切割发夹结构时无一例外地将导致对应于mRNA 5'端序列出现缺失和重排,因而该方法目前很少使用。? (2) 置换合成法该方法利用第一链在反转录酶作用下产生的cDNA:mRNA杂交链不用碱变性,而是在dNTP存在下,利用RNA酶H在杂交链的mRNA链上造成切口和缺口。从而产生一系列RNA引物,使之成为合成第二链的引物,在大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的作用下合成第二链。该反应有3个主要优点: (1) 非常有效; (2) 直接利用第一链反应产物,无须进一步处理和纯化; (3) 不必使用S1核酸酶来切割双链cDNA中的单链发夹环。РRT-PCR
全文预览
