式反应(PolymeraseChainReaction,PCR)是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术,它可看作是生物体外的特殊DNA复制,PCR的最大特点是能将微量的DNA大幅增加。二、PCR的发展史1953年,沃森和克里克发现了DNA双螺旋的结构,开启了分子生物学时代,极大地推动了核酸生物化学,分子生物学及分子遗传学等各类生命科学的迅速发展。1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。1988年初,Keohanog改用T4DNA聚合酶进行PCR,其扩增的DNA片段很均一,真实性也较高,只有所期望的一种DNA片段。但每循环一次,仍需加入新酶。1988年Saiki等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermusaquaticus)中提取到一种耐热DNA聚合酶,此酶的发现使PCR广泛的被应用。实时荧光定量PCR技术于1996年由美国AppliedBiosystems公司推出,由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃,而且与常规PCR相比,它具有特异性更强、PCR污染少、自动化程度高等特点,目前已得到广泛应用。第一代:手动/机械手式水浴基因扩增用三个恒温水浴箱,分别将三个水浴温度恒定在三个温度:PCR的高温变性温度(如94℃)低温复性温度(如58℃),适温延伸温度(如72℃)。再用一个装有PCR标本试管的提篮,用手工在不同温度的水浴箱中依次水浴。这种方法的特点是:实验人员劳动强度大,容易因疲劳引起差错;而优点是:设备简单,投资少,与自动化基因扩增仪相比,它无须升降温过程,实验时间短,试验更接近理想PCR反应条件。第二代:自动化控制型PCR使用广泛及具有代表性,采用琼脂糖电泳的方式对PCR产物进行分析,但存在着操作繁琐、只适用于定性研究、交叉污染风险大等不足。且无法对起始模板准确定量,无法对扩增反应实时检测。
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