第九章 PCR技术及其在医学上的应用

端是人工合成的引物,是特定的,3 '端没有固定的终止点Р特定的的扩增产物在第2个循环中出现,以后快速扩增,成为主要扩增产物РBРBРAРAРBРAРBРAРAРBРBРAРBРAРAРBРBРAРBРBРAРAРBРAРBРAРBРAР循环3Р变性、退火Р延伸Рn个循环后,5 '端是特定的人工合成的引物,3 '端没有固定的终止点的DNA链扩增量为2n。РTaq聚合酶的性能?模板DNA的拷贝数?底物dNTP浓度?其他多种因素Р30个循环后出现“平台效应”? 平台效应出现的早晚取决于:Р二、PCR技术的特点Р高度的敏感性:是最主要的特点,25个循环可扩增106倍,它可对单拷贝、单根头发、一滴血等微量标本进行分析?高度的特异性:取决于2个引物设计的好坏,依赖于引物与模板结合的正确性,退火温度?操作简便、快捷?适用样品的广泛性Р第二节 PCR系统的组成?及PCR最适条件Р耐热DNA聚合酶?寡核苷酸引物?dNTP?PCR反应缓冲液?模板DNA?PCR循环数?易发生的问题及解决方法Р一、耐热DNA聚合酶Р必需金属离子 Mg2+ Mg2+ Mg2+ Mg2+?3 ' → 5 '外切活性- - + -?5 ' → 3 '外切活性+ + + + ?逆转录活性+(Mn2+) + (Mn2+) 未定未定?耐受100℃- - + +Р该酶的出现使PCR操作大大简化,克服了以前每一循环反复加Klenow酶的缺点Р各种耐热DNA聚合酶的特性РTaq Tth VENT SacРTaq DNA聚合酶的种类Р天然酶---嗜热水生菌分离纯化?基因工程酶---Amlpi TaqTMР5 ' →3 ' DNA聚合酶?在Mn2+存在下,逆转录酶活性最佳?有5 ' →3 '外切酶活性?无3 ' →5 '外切酶活性,无校正功能?PCR产物末端加1个非模板依赖性碱基,优先为A,是TA克隆的基础РTaq DNA聚合酶的特性