CR产物或DNA克隆片段的精确核苷酸序列。Р一、Sanger双脱氧链终止法原理Р加入特殊核苷酸底物——双脱氧核苷三磷酸(ddNTP),与普通dNTP不同,在脱氧核糖的3’位置缺少一个羟基,不能形成磷酸二酯键。?例如,存在ddCTP、和四种dNTP(其中一种为α-32P标记)的情况下,将引物、模板和DNA聚合酶一起保温,即可形成以ddC残基为3’端结尾的一系列长短不一片段的混合物。经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离制得的放射性自显影区带图谱将为新合成的不同长度的DNA链中C的分布提供准确信息,从而将全部C的位置确定下来。?采用类似的方法,在ddATP、ddGTP和ddTTP存在的条件下,可同时制得分别以ddA、ddG和ddT残基为3‘端结尾的三组长短不一的片段。?将制得的四组混合物全部平行地点加在变性聚丙烯酸受凝胶电泳板上进行电泳,每组制品中的各个组分将按其链长的不同得到分离,从而制得相应的放射性自显影图谱。РA G C T A G C T A G C T A G C T A G C T A G C TР循环测序反应中的同一反应管内,四色荧光标记的四种ddNTPs与未标记的四种正常dNTPs竟争性地掺入到正在延伸的DNA链末端,经过30个左右的循环测序反应后,就可随机但又特异地扩增到不同长度的DNA片段;?测序仪的专用激光扫描镜头实时扫描不同大小的DNA片段在相应时间通过垂直电泳胶读数区时发射的荧光,将不同大小DNA片段发射的荧光实时地传递给计算机测序数据实时收集软件,将电泳结果转换成胶图文件及原始数据信号。当电泳完毕后,DNA序列分析软件通过分析胶图文件及原始数据信号,得到最终的测序结果。Р荧光标记测序Р循环测序反应原理示意图Р测序峰图的简单分析Р我们所用的峰图分析软件为:?Sequence Scanner V 1.0,Bioedit等РDNA测序仪的发展Р平板凝胶电泳毛细管电泳
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