系统——GenomeSequencer20System,被《Nature》杂志以里程碑事件报道,开创了边合成边测序(sequencing-by-synthesis)的先河。之后,454公司被罗氏诊断公司以1.55亿美元收购。454测序原理测序实验流程:1、文库制备:根据样品的种类和实验目的,将基因组DNA/cDNA片段化处理至400-800bp间,经末端修复与特异性接头连接等修饰后变性处理回收单链的DNA(sstDNA);然后和两个44个碱基长的衔接子(adaptor)A、B进行平端连接。A、B衔接子各自含有20个碱基的PCR引物序列、20个碱基的测序引物序列和4个碱基的对照序列(TACG),除此之外,B衔接子的5’端还标记有一个生物素基团,供后续的分离合适的测序模板使用。测序实验流程:2、Emulsion PCR:特定比例的单链DNA文库被固定在特别设计的DNA捕获磁珠上,使大部分磁珠磁珠携带了一个独特的单链DNA片断。磁珠结合的文库被扩增试剂乳化,形成油包水的混合物,每个独特的片断在自己的微反应器里进行独立的扩增,而不受其他的竞争性或者污染性序列的影响。整个片段文库的扩增平行进行。扩增后产生了几百万个相同的拷贝。随后,乳液混合物被打破,扩增后仍结合在磁珠上的片段既可被回收纯化用于后续的测序实验;测序实验流程:3、测序反应:携带DNA的珠子与其他反应物混合物,随后放入PTP板中进行后继的测序。PTP孔的直径(29um)只能容纳一个珠子(20um)。然后将PTP板放置在GSFLX中,测序开始。每一个与模板链互补的核苷酸的添加都会产生化学发光的信号,D照相机所捕获;测序实验流程:4、数据分析:GSFLX系统在10小时的运行当中可获得100多万个读长,读取超过4-6亿个碱基信息,通过GSFLX系统提供两种不同的生物信息学工具对测序数据进行分析。454Pyrosequencing
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