ainterminationmethod)ddNTP与普通dNTP不同之处在同它们在脱氧核糖的3'位置缺少一个羟基。它们可以在DNA聚合酶作用下通过其5'三磷酸基团掺入到正在增长的DNA链中,但由于没有3'羟基,它们不能同后续的dNTP形成磷酸二酯链,因此,正在增长的DNA链不可能继续延伸。这样,在DNA合成反应混合物的4种普通dNTP中加入少量的一种ddNTP后,链延伸将与偶然发生但却十分特异的链终止展开竞争,反应产物是一系列的核苷酸链,其长度取决于从用以起始DNA合成的引物末端到出现过早链终止的位置之间的距离。在4组独立的酶反应中分别采用4种不同的ddNTP,结果将产生4组寡核苷酸,它们将分别终止于模板链的每一个A、每一个G或每一个T的位置上。生成互相独立的若干组带放射性标记的寡核苷酸,每组寡核苷酸都有固定的起点,但却随机终止于特定的一种或者多种残基上。由于DNA上的每一个碱基出现在可变终止端的机会均等,因此上述每一组产物都是一些寡核苷酸混合物,这些寡核苷酸的长度由某一种特定碱基在原DNA全片段上的位置所决定。在可以区分长度仅差一个核苷酸的不同DNA分子的条件下,对各组寡核苷酸进行电泳分析,只要把几组寡核苷酸加样于测序凝胶中若干个相邻的泳道上,即可从凝胶的放射自影片上直接读出DNA上的核苷酸顺序。方法概述:脱氧核甘酸与双脱氧核苷酸结构比较少一个-OH技术路线与要求制备单链模板↓将单链模板与一小段引物退火↓加入DNA多聚酶4种脱氧核苷酸分别加入少量4种双脱氧核苷酸↓将4种反应产物分别在4条泳道电泳↓根据4个碱基在4条泳道的终止位置读出基因序列A克隆于质粒中DNA→用碱或热变性BM13克隆单链DNAC噬粒克隆DNADPCR产生单链DNAA高酶活性B无5’→3´外切酶活性C无3´→5´外切酶活性ddATP/ddCTP/ddGTP/ddTTP的3’碳原子连接的是氢原子,不是羟基
全文预览
