义,为进一步以分子生物学技术检测临床异烟肼耐药株奠定基础.本研究还建立PCR-SSCP技术对临床耐异烟肼菌株进行突变体的筛检,并引入电转化技术,将野生型katG基因与突变体基因转化进入高度耐异烟肼、katG基因缺陷的耻垢分支杆菌(M.Smegmatis),比较转化后M.SmegmatiS对异烟肼药敏的变化,从而判断突变体在耐药机制中的意义。由于本课题的三个研究部分既相互联系又各自独立,因此本文将分三个部分分别予以叙述讨论。第一部分结核分支杆菌KatG基因的克隆及功能的初步分析自1992年首次在异烟肼高度耐药菌株中发现katG基因缺失以来【2】,对于katG基因变异或缺失造成分支杆菌对异烟肼耐药的研究已较为深入。研究表明INH实际上是一个药物前体,需经结核分支杆菌过氧化氢酶一过氧化物酶活化后才发挥抗结核作用,而过氧化氢酶一过氧化物酶则由KatG基因所编码[“。但为何其他细菌如大肠杆菌等虽也产生katG,而异烟肼唯独对结核分支杆菌野生株有效,以及过氧化氢酶一过氧化物酶如何活化异烟肼、发生变异后的酶是结构上抑或是功能上的改变而导致耐药的确切机制仍然不清,、特别是近年来对于不同突变位点的变异对药物敏感性的影响颇有争议【8】,那么不同突变体的表达产物在功能上有何差异呢?这些均需要对katG基因表达的产物进行研究。由于结核分支杆菌生长较缓,而且具有较强的传染性,长期以来在提取结核分支杆菌蛋白质进行研究的进展较缓,因此有必要利用表达系统来获得重组蛋白以供研究,从而有可能将基因变异与异烟肼耐药相关的蛋白功能相结合进行更为深入的研究。本研究用PCR方法克隆katG基因并将其构建在表达载体pET24b上,将含有katG基因的pET24b—katG表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,以IPTG诱导实现J[atG基因的高表达,为进一步研究katG基因与结核杆菌对INH的耐药机制奠定基础。卜
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