克隆及诱导蛋白步骤

Agilent 2 ml的螺纹盖进样瓶中加入下列反应体系:РMops (pH , 200 mM)Р100 μLРdithiothreitol (1 M)Р2 μLРglycerol (100% v/v)Р200 μLРMgCl2 (100 mM)Р200 μLРMnCl2 (100 mM)Р1 μLРРNaWO4 (100 mM)Р4 μLРNaF (500 mM)Р μLРNPP/GPP/FPP/GGPPР30/ μLРH2OР μLР纯化的蛋白溶液Р500 μLРTotal volumeР1 mLР加入500 μL正己烷收集酶活产物, 用封口膜密封进样瓶。恒温水浴锅30°C水浴1 h。涡旋并离心, 吸200 μL上清，使用 μm有机滤膜过滤, 转移至新的进样瓶, 封口膜密封, 放入-20°C冰箱保存或直接吸取1 μL进行GC-MS定性与定量检测。Р6 GC-MS分析方法Р使用岛津单四极杆气质联用仪 (GCMS-QP2010 SE) 进行挥发物定性定量分析。毛细管柱为Rxi-5Sil MS (30 m× mm× μm, RESTEK, USA)。载气为He, 进样口温度为250°C, 不分流, 进样口流速和柱流速分别为10 mL/min和1 mL/min。Р进样量1 μL, 程序升温为: 40°C (保持1 min) 以4°C /min升到130°C (保持5 min), 以10°C /min升到250°C (保持5 min)。РMS工作条件: GC分离出的挥发物依次进入四极杆质谱, 电离方式: EI 70 ev, He作为载气, 流速为1 ml/min, 源温和传输线温度都为250°C, 扫描范围50-650 amu, 扫描速度2500 amu/s。Р挥发物组分的定性通过比对NIST图库中的质谱图完成, 各组分的定量通过其峰面积与内标癸酸乙酯的峰面积的比较进行折算完成。