绿色荧光蛋白基因在大肠杆菌中的克隆与表达

绿色荧光蛋白基因在大肠杆菌中的克隆与表达Р概览РGFP?pEGFP-N3和pET-28a?实验内容?实验目的?实验原理?实验过程РGFPР绿色荧光蛋白(GreenFluorescent Protein,简称GFP)РGFPР基因来源于Jellyfish Aequorea Victoria, 是Shimomura等于1962年发现的蛋白质,由238个氨基酸组成,分子量约为27Kd。GFP在包括热、极端PH和化学变性剂等苛刻条件下都很稳定?在荧光显微镜下,用波长约490 nm的紫外线激发后,即可观察到绿色荧光,直接、简捷、便于检测; ?无需任何的作用底物或共作用物,检测的灵敏度不受反应效率的影响,保证了极高的检出率; ?蛋白本身性质稳定; ?可在多种异源生物中表达且无细胞毒性; ?其基因片段长度较小(约717 bp),易于构建融合蛋白,且融合蛋白仍能保持荧光激发活性?EGFP是一种优化的突变型GFP,使其产生的荧光较普通GFP强35倍,大大增强了其报告基因的敏感度。EGFP与其他蛋白的融合表达已有很多成功的例子。РGFPР丝氨酸-酪氨酸-甘氨酸生色基团?蛋白质折叠,生色基团得以“亲密接触”, 经环化形成咪唑酮,并发生脱水反应。但此时还不能发射荧光,只有当有分子氧存在的条件下,发生氧化脱氢,方能导致绿色荧光蛋白发色团的“成熟”,形成可发射荧光的形式。РGFPР蓝光、绿光与黄光?基因克隆?变体РGFPР分子标记?药物筛选?融合抗体?生物传感器?信号传导Р标记!РpEGFP-N3Р真核细胞表达载体,pEGFP-N3载体上携带有EGFP蛋白表达基因?很强的复制能力?高效的功能强大的启动子SV40和PCMV?多克隆位点?具有neo基因,可以采用G418来筛选已成功转染了该载体的靶细胞РpEGFP-N3