、废物(液)缸、Р37℃孵箱、湿盒Р实验方法:Р1. 单个脾细胞的制备Р ①取健康ICR小鼠,18-22g,摘眼球放血、脱颈椎处死,取脾Р② 200目铜网上研磨脾脏,收集脾细胞悬液,2000rpm离心5min,弃上清Р ③用PBS洗3次,每次以500 rpm短时低速离心除去细胞碎片,以200目不锈钢滤网过滤去除细胞团块。作细胞计数并调整细胞浓度为(2~5)×107/ml。常温下放置,分离前用小牛血清悬起细胞浓度为l×107/ml的单细胞悬液备用。Р 2. 分离单个核细胞Р①取上述单细胞悬液1ml,小心加于2ml的细胞分离液之液面上Р②以2000转/分离心(半径15cm水平转子)15分钟,此时离心管中由上至下细胞分四层。第一层;为胎牛血清液层。第二层;为环状乳白色淋巴细胞。第三层;为透明分离液层。第四层;为红细胞层。Р③收集第二层细胞放入含PBS 4-5毫升的试管中,充分混匀后,以2000转/分离心5分钟。沉淀经反复洗2次即得所需细胞。Р附:Р1. 有关淋巴细胞分层液的注意事项:Р1)启封后应置4℃保存避免微生物的污染。Р2)细胞分离液从冰箱取出后,不可立即使用,需待溶液温度升至室温时,摇匀后使用。Р3)整个分离过程中,温度应控制在18-28℃且在无菌环境下,避免微生物的污染,否则会影响分离质量。Р 2. 细胞计数要点:Р1)进行细胞计数时,要求悬液中细胞数目不低于l04个/ml,如果细胞数目很少要进行离心再悬浮于少量培养液中;显微镜下计数时,遇到2个以上细胞组成的细胞团,应按单个细胞计算。如果细胞团>10%,说明细胞分散不充分;或细胞数<200个/10mm2或>500个/10 mm2时,说明稀释不当,需重新制备细胞悬液。Р2)要求细胞悬液中的细胞分散良好,否则影响计数准确性。Р3)取样计数前,应充分混匀细胞悬液,尤其是多次取样计数时更要注意每次取样都要混匀, 以求计数准确;
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