加温(防止镊子粘蜡)后,左手持蜡杯,右手把加温的镊子放在蜡口(直立状)倒蜡时让石蜡沿镊子注入包埋框内。3)迅速镊取组织块放入包埋框石蜡内,切面朝下放正置入框底并轻轻压平,以保证不再有气泡。4)待石蜡表面凝固前将标签贴于其上,需注意勿使标签与标本混淆,当蜡块冷至蜡面有透明蜡膜时,浸入冷水中迅速使其冷却,否则蜡内常形成结晶。5)蜡块完全硬固后除去铜框,以保证蜡彻底凝固,立即修切,准备制成切片或储藏备用。5:切片制作:1).室温过高时,可将修好的蜡块放到冰箱中冷却一定时间。在夏季时可用冰块冷却刀和组织块,减少刀与组织块在过程中产生的热时,使石蜡保持合适的硬度以利于切片。2).切片经30%的乙醇初展后,再用载玻片捞起蜡带放入展片仪水盒内(一般水温为45℃左右)。待蜡片带中的组织展平后,即可进行分片和捞片。3).切片时要及时清洁刀口、除去蜡屑,否则易引起破碎。6:贴片:待切片在恒温水内充分摊开展平后,将载玻片垂直插入水中以毛面轻靠切片,并用毛笔将切片一边拨于玻片上,随即将玻片直立提起。三、免疫组化:取出并恢复至室温,PBS冲洗,3分钟×3次。3%H2O2去离子水(无色液体)孵育10分钟,以消除内源性过氧化物酶活性,PBS冲洗,3分钟×3次。滴加试剂A(蓝色液体——封闭用正常血清工作液)室温孵育20分钟,倾去,勿洗。滴加按照:LC3:1:100,LAMP-2:1:100比例稀释的一抗放入湿盒内4℃过夜取出并恢复至室温,PBS冲洗,3分钟×3次。滴加试剂B(黄色液体——生物素化二抗工作液),室温或37℃孵育10~15分钟。PBS冲洗,3分钟×3次。滴加试剂C(橙色液体——辣根酶标记链霉卵白素工作液),室温37℃孵育15分钟。PBS冲洗,3分钟×3次。DAB显色剂显色。自来水充分冲洗(约5分钟)。苏木素复染,脱水,透明。中性树脂封片。四实验结果及分析实验结果:棕黄色部位为抗原阳性表达部位。
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