核细胞(PBMC)Р粒细胞Р红细胞Р小鼠脾脏位于上腹部左后侧,体积较大,长条形态,属于外周免疫器官。外周血中淋巴细胞可经再循环注入脾脏等外周免疫器官的特定区域,所以富含各类免疫细胞。Р解剖图Р胸腺位于胸腔胸骨后、纵隔前上方,覆盖在心脏前上方的白色组织。通常小鼠鼠龄越小,胸腺体积相对越大。Р取脾脏Р(一)取小鼠脾脏(3人1组)?小鼠颈椎脱位处死?用拇指和食指往下按住鼠头,另一只手抓住鼠尾,用力稍向后上方一拉,使之颈椎脱臼,造成脊髓与脑髓断离?取其后右侧卧位,消毒左侧背腹交界处皮肤,剪取脾脏并尽量将去除脂肪及筋膜组织。Р实验步骤Р1Р2Р3Р4Р6Р5Р7Р8Р9Р10Р超净台下操作全过程Р可重复滤过Р(二)制备单个核细胞悬液:?将脾脏置于盛有5mLPBS缓冲液的平皿中,然后再置于尼龙指套中。用针芯轻轻碾磨使单个核细胞通过尼龙指套悬浮于平皿中;?吸取平皿中细胞悬液(再次用尼龙指套过滤)置于刻度离心管中,加PBS缓冲液(可冲洗培养皿)至10mL,以1500rpm离心5min。弃去上清,弹散细胞沉淀,加ACK3ml,轻轻吹打混匀并放置3-4min,以破坏红细胞。然后加PBS缓冲液至10ml,以指套过滤至另一15mL离心管,以1500rpm离心5min;?弃去上清,弹散细胞沉淀,加PBS缓冲液至10ml,吹打混匀即为小鼠脾脏单个核细胞悬液。?取100uL至EP管中,进行计数和活力测定(建议5倍稀释)?以1500rpm离心5min,根据计数结果稀释到合适的浓度?注:减少操作的时间,并放置冰上或低温离心机里以保证细胞活力Р实验步骤Р(三)计算细胞浓度?将上述细胞悬液做一定倍数的稀释;(建议5倍稀释)?混匀稀释后,取1滴加至细胞计数板中,计数细胞计数板中4大方格细胞总数;?计算细胞总数:? 细胞总数=平均每个大方格中细胞数(4个大方格细胞总数/4)×104×稀释倍数× 总体积。Р实验步骤
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