实验设计——绿色荧光蛋白的表达

的培养液),摇匀菌块。Р4.5 用玻璃涂布器将溶液均匀涂布在含Kana的LB固定培养基上,正置培养皿半小时后,37℃培养箱中倒置培养皿过夜。Р4.6 第二天早上观察结果。Р菌落PCR法鉴定阳性克隆РT7启动子正向引物:5’-taa tac gac tca cta tag gg-3РT7启动子反向引物:5’-tgc tag tta ttg ctc agc gg-3Р5.1在0.2mlEP管内配制25ul PCR反应体系5个:Р反应物Р体积(ul)РDdH2OР18.5Р10×BufferР2.5РMgCl2Р1.5Р4×dNTPР1Р引物1Р0.5Р引物2Р0.5РTaq酶Р0.5Р菌落Р挑一个Р5.2用灭菌枪头挑单菌落接触EP管内,混匀瞬时离心Р5.3放入PCR仪中,设置反应程序:Р1)94℃预变性 5minР2)94℃变性30SР3)55℃退火30SР4)72℃延伸1minР重复步骤2-4 30次Р72℃延伸10minР5.4取9ul反应液加1ul 10×loading Buffer做电泳检测,分析所得目的片段的大小,检测是否与理论目的基因大小相符。Р6.目的荧光蛋白基因的表达Р6.1取出感受态细胞BL21让其在冰上自然解冻,每200ul解冻的感受态细胞加入5ul pET-28a-EGPF质粒,混匀后冰浴30min。Р6.2 42℃热冲击90S,立即置于冰浴5min。Р6.3再将感受态细胞混合物转入0.8ml的LB培养基,于37℃摇床中培养1h。期间将200ul的24mg/ml IPTG涂布在含Kana的LB培养基上,待用。Р6.4 1h后,6000r/min离心5min,去掉上清液(约留200ul的培养液),摇匀菌块。Р6.5用玻璃涂布器将溶液均匀涂布在含IPTG和Kana的LB固体培养基上,正置培养皿半小时后,37℃培养箱中倒置培养皿过夜。Р6.6第二天早上观察结果。