液加到1.5g的琼脂内,于水浴中加温,搅拌,使琼脂完全溶解,趁热用纱布过滤,待溶液冷却到65℃左右时,加入叠氮钠(NaN3),使其在溶液中的浓度为0.1%。用移液管把琼脂放在干净平皿或玻片上,约3mm厚,待其冷却,完全凝固后,用打孔器打孔。中央孔内加适量抗原(容量为50μl),周围各孔内分别加入Р50μl 1:2、1:4、1:8、1:16、1:32及不稀释的抗血清,37℃下孵育24h,观察有无沉淀线产生以判断血清的稀释度。Р 注意事项Р 1. 免疫用实验动物的抗体反应性个体差异性较大,因此免疫时至少应选用两只以上动物。另外,不能使用妊娠动物。Р 2. 免疫用的抗原必须经FCA或FIA充分乳化后才能注射,否则将明显影响抗原的免疫效果。上述制备乳化抗原的方法较费时、费力。采用H-81微型振荡混合器法或三腔管研磨法制备。前者是将抗原液与佐剂按比例混合后,置于混合器上使之剧烈振荡(频率2900转/分,振幅6mm);后者是将免疫用的佐剂和抗原液按比例混合后,吸入注射器内再将注射器连接于三腔管上反复抽吸研磨。这两种方法约1小时即可使抗原充分乳化。Р 3. 佐剂一方面可提高特异性免疫反应的效果获得高效价的免疫血清,但若抗原不纯时,可使抗原中极微量的污染物(0.005mgN)产生抗体,以致导致免疫血清的纯度受到影响。另外,有些实验动物种系对BCG过敏,尤其是豚鼠,当再次注射完全佐剂时,可以引起变态反应而导致免疫失败。为此,第二次免疫注射时应减少佐剂中BCG的含量或改用不完全佐剂,以减少和防止变态反应的发生。Р 4. 抗原的剂量决定于抗原的种类。对免疫原性强的抗原剂量应相别较少,免疫原性弱的抗原剂量可相对较多。抗原的用量一般以体重计算。在使用佐剂的情况下,一次注入的总剂量以0.5mg/kg体重为宜。如不加佐剂时剂量可加大10倍。另外,免疫周期长者可少量多次注射,免疫周期短者可较大量少次注射。
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