这信号强度只有未抑制样品信号的50%以下,这样可能会出现假阴性。因此,特异性确证临界点应该通过客观的方法进行评估,在弱阳性样本附近评估分析方法的变异性。有多种试验方法可以用于特异性确证临界点的评估。建议在筛选临界点的验证过程评估特异性确证临界点。筛选临界点评估试验所用到的药物初治样本可以加入药物后再以相同的方式检验。计算未加标药物样本(抑制)的均值和标准偏差(SD),特异性确证临界点为抑制平均值加上3.09 倍的SD值(如果预期假阳性率为1%)。与筛选临界点的评估一样,特异性确证临界点的评估过程也需要排除异常值。特异性确证临界点的详细计算步骤参见附录C(AppendixC)。在某些实验室,会在低于筛选临界点的样品(建议样本量大于等于25)中加标阳性对照使其信号值等于或稍微大于筛选临界点。用过量药物孵育后,计算平均抑制百分率,并通过“×SD”值进行校正,确定特异性确证临界点(“×”取决于适当的假阳性率)。必须确保阳性对照样品的信号不会高于筛选临界点太多, 以免使假阳性率增高。这一方法确定的特异性确证临界点高度依赖于所使用的阳性对照品。值得注意的是,研究样本中的低抗药抗体亲和力样本(特别是多价IgM, 亲和力成熟的IgG)可能会不被抑制。因此,使用单一阳性对照品确定的特异性确证临界点可能无法有效地将一个研究样品分为特异性样品还是非特异性样品。 Neyer等提出了一种基于T检验(t-test)的表示抗药抗体特异性的方法, 该方法的原理是比较未加标药物样品与加标药物样品的信号值。然而,该分析法的竞争性抑制结果的观测样本量相当有限,没有考虑到生物变异的影响。然而,以上列举的方法均比人为的50%抑制率更为客观、可靠。一些研究人员进行抗体免疫耗竭(如ProteinA),这一方法并不涉及特异性药物,它只能证明信号来源于免疫球蛋白。这种方法可以用作支撑测试,不建议作为药物特异性的决定性试验。
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