,离心,1200rpm,8min;弃上清,用吸管吸净残留液体,以免影响聚乙二醇(PEG)浓度。轻轻弹击离心管底,使细胞沉淀略松动。Р (2) 90s内加入37℃预温的1ml 45%PEG(分子量4000)溶液,边加边轻微摇动。37℃水浴作用90s。Р (3) 加37。C预温的不完全培养液以终止PEG作用,每隔2min分别加入1ml、2ml、3ml、4ml、5ml和6ml。Р (4) 离心,800rpm, 6min。Р (5) 充上清,用含20%小牛血清HAT选择培养液重悬。Р (6) 将上述细胞,加到已有饲养细胞层的96孔板内,每孔加100μl。一般一个免疫脾脏可接种4块96孔板。Р (7) 将培养板置37℃、5%CO2培养箱中培养。Р 选择杂交瘤细胞及抗体检测Р 1. HAT选择杂交瘤细胞Р 脾细胞和骨髓瘤细胞经PEG处理后,形成多种细胞的混合体,只有脾细胞与骨髓细胞形成的杂交瘤细胞才有意义。在HAT选择培养液中培养时,由于骨髓瘤细胞缺乏胸苷激酶或次黄嘌呤鸟嘌呤核糖转移酶,故不能生长繁殖,而杂交瘤细胞具有上述两种酶,在HAT选择培养液可以生长繁殖。Р 在用HAT选择培养1~2天内,将有大量瘤细胞死亡,3~4天后瘤细胞消失,杂交细胞形成小集落,HAT选择培养液维持7~10天后应换用HT培养液,再维持2周,改用一般培养液。在上述选择培养期间,杂交瘤细胞布满孔底1/10面积时,即可开始检测特异性抗体,筛选出所需要的杂交瘤细胞系。在选择培养期间,一般每2~3天换一半培养液。Р 2. 抗体的检测Р 检测抗体的方法应根据抗原的性质、抗体的类型不同,选择不同的筛选方法,一般以快速、简便、特异、敏感的方法为原则。Р 常用的方法有:Р (1) 放射免疫测定(RIA)可用于可溶性抗原、细胞McAb的检测Р (2) 。酶联免疫吸附试验(ELISA)可用于可溶性抗原、细胞和病毒等McAb的检测。
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