补加不完全培养基至30ml,充分混匀。Р2.2.2.5.2、 1000r/min离心5-10分钟,将上清尽量吸净。Р2.2.2.5.3、在手掌上轻击融合管底,使沉淀细胞松散均匀;置40℃水浴中预热。Р2.2.2.5.4、用1ml吸管在1分钟左右(最佳时间为45秒)加预热至40℃的50% PEG(PH 8.0)1ml,边加边轻轻搅拌。Р2.2.2.5.5、用10ml吸管在90秒内加20-30ml预热至37℃的不完全培养基;20-37℃静置10分钟。Р2.2.2.5.6、 1000r/min 5分钟;弃去上清。Р2.2.2.5.7、加入5ml HAT培养基,轻轻吹吸沉淀细胞,使其悬浮并混匀,然后补加含腹腔巨噬细胞的HAT培养基至80-100ml。Р2.2.2.5.8、分装96孔细胞培养板,每孔0.10-0.15ml;分装24孔板,每孔1.0-1.5ml;然后将培养板置37℃,6% CO2培养箱内培养。Р2.2.2.5.9、 5天后用HAT培养基换出1/2培养基。Р2.2.2.5.10、 7-10天后用HT培养基换出HAT培养基;(第14天后可用普通完全培养基)。Р2.2.2.5.11、经常观察杂交瘤细胞生长情况,待其长至孔底面积1/10以上时吸出上清供抗体检测。Р2.2.3、杂交瘤细胞筛选Р杂交瘤细胞在融合后2周左右即可筛选,即把分泌所需抗体的杂交瘤孔从众多的孔中选出来,通常也称为抗体检测。抗体检测的方法很多,通常根据所研究的抗原和实验室的条件而定。但作为杂交瘤筛选的抗体检测方法必须具有快速、准备、简便,便于一次处理大量样品等特点。因为往往有几百个样品需要在短短几个小时就报告结果,以便决定杂交瘤细胞的取舍。所以选用抗体检测方法的原则是快速、敏感、特异、可靠、花费小和节省人力。一般说来,在融合之前就必须建立好抗体检测方法,并克服可能存在的问题。另一个重要问题是抗体检测方法所需要的
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