细胞冻存、复苏、传代、转染(超详细版)

fPlatingMediumDNA(ug)andDilutionVolume(ul)Lipofectamine2000(ul)AndDilutionVolume(ul)6-well1052ml4.0ugin250ul10ulin250ul(4)将质粒加入OPTI-MEM,轻轻混匀。(5)将Lipofectamine2000加入OPTI-MEM后轻轻混匀后,并计时孵育5分钟。(6)将质粒加入Lipofectamine2000中,轻轻混匀后,计时孵育20分钟。(7)20分钟后缓慢将Lipofectamine2000-质粒混合物加入培养孔中。(8)37℃、5%CO2培养箱中培养24-48小时。(9)提取细胞蛋白。注意事项传代细胞的准备细胞在转染前24h传代,待细胞密度达90%丰度时即可进行转染。如果转染前细胞生长不足12h,细胞就不能很好地吸附在培养皿上,与脂类接触时易于脱落。用Lipofectin转染时,不要用聚丙烯试管,因为Lipofectin中的阳离子脂类会与聚丙烯发生非特异结合,而影响转染结果。在添加DNA-脂质体混合液前,用无血清培养液充分洗涤转染细胞很重要,因为血清会强力抑制转染;有些胞外基质复合物,如硫酸蛋白聚糖,也可抑制转染。GFP表达的影响因素主要与转染时的温度、PH值和观察时间有关。同一表达载体转染同一种细胞后,分别在33℃和37℃条件下培养,则33℃条件下培养者可观察到较强的荧光,而37℃条件下培养者荧光较弱,其原因可能是37℃时三肽环状结构不易形成。培养液的PH值也显著影响GFP的荧光特性,转染后的细胞于33℃、5%CO2条件下培养,在培养液为碱性时荧光较强,培养液为酸性时荧光减弱。荧光强度一般在转染后48h最强,这可能是一方面与GFP的表达量有关,另一方面与细胞的生长状态有关。因此,在实验中应严格控制转染时的温度、PH值和观察时间,以获得较好的实验结果。