代:NgAgo - gDNA 韩春雨Р基因编辑发展史РZFN 基因组编辑技术РZFN 技术是第一代基因组编辑技术,其功能的实现是基于具有独特的DNA序列识别的锌指蛋白发展起来的。? 1986年Diakun 等首先在真核生物转录因子家族的 DNA 结合区域发现了Cys2- His2锌指模块。? 1996年,Kim等首次人工连接了锌指蛋白与核酸内切酶。? 2005年,Urnov等发现一对由4个锌指连接而成的ZFN可识别24 bp的特异性序列,由此揭开了ZFN在基因组编辑中的应用。РZFN 由锌指蛋白(ZFP)和 FokⅠ核酸内切酶组成。其中,由 ZFP 构成的 DNA 识别域能识别特异位点并与之结合,而由FokⅠ构成的切割域能执行剪切功能,两者结合可使靶位点的双链DNA 断裂(DSB)。于是, 细胞可以通过同源重组(HR)修复机制和非同源末端连接(NHEJ)修复机制来修复 DNA。HR 修复有可能会对靶标位点进行恢复修饰或者插入修饰,而 NHEJ 修复极易发生插入突变或缺失突变。两者都可造成移码突变,因此达到基因敲除的目的。РZFN 诱导的基因组编辑技术可应用于很多物种及基因位点,具有较好的发展潜力。? 缺点:? (1)以现有的策略设计高亲和性的 ZFN,需要投入大量的工作和时间;(2)在细胞中持续表达 ZFN 对细胞有毒性;(3)虽然三联体设计具有一定特异性,但仍然存在不同程度的脱靶效应。РTALEN 基因组编辑技术Р2009 年,研究者在植物病原体黄单胞菌(Xanthomonas)中发现一种转录激活样效应因子(TAL蛋白),它的核酸结合域的氨基酸序列与其靶位点的核酸序列有恒定的对应关系,一个模块单元识别一个碱基,简单且特异性极好。随后,TALE特异识别 DNA 序列的特性被用来取代 ZFN技术中的锌指蛋白。它可设计性更强,不受上下游序列影响,具备比ZFN 更广阔的应用潜力。
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