遗传病)Р基因编辑的三大利器РZFN (Zinc-finger nucleases, ZFN)?TALEN(transcription activator-like effector nucleases)?CRISPR/Cas (clustered regulatory interspaced short palindromic repeat /Cas-based RNA-guided DNA endonucleases)Р特异性?DNA识别域Р非特异性?核酸内切酶Р+РZFN原理РZFN=蛋白的DNA识别域+核酸内切酶РDNA识别域:? 由一系列 Cys2-His2锌指蛋白(zinc-fingers)串联组成(一般3~4个),每个锌指蛋白识别并结合一个特异的三联体碱基。Р8Р核酸内切酶:? 非特异性核酸内切酶FokI,形成二聚体时切割双链DNAР两条ZFN之间具有被称为“间隔区”的spacer结构,该结构的长度以5~6bp为宜,7bp也能正常工作,合理的“间隔区”设计才能保证ZFN二聚体拥有最佳的工作空间。Р9РZFN技术的缺陷РDNA识别域虽然具有较强的特异性识别能力,但是其识别的序列长度比较有限。?因为ZFN剪切的过程不完全依赖同源二聚体的形成,所以一旦形成异源二聚体,就很可能造成脱靶效应;?如果出现脱靶,可能导致DNA的错配和序列改变,产生较强的细胞毒性。当这些不良影响积累过多,超过细胞修复机制承受的范围时,便会引起细胞的凋亡。?另一方面,该手段在细胞内部操作的精确程度不足,则可能会引起相关基因突变,引发癌症等。?ZFN 作为基因治疗的手段之一,如果在生物体内使用,可能会引发免疫反应。而现有的研究手段尚不能预测引入的ZNF蛋白是否会引起免疫系统的进攻。?到目前为止,ZFN技术只能用于体外操作(in vitro),在对人体提取的细胞进行处理之后,再导入回输到病人体内。
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