固相的抗原或抗体,?(2)酶标记的抗原或抗体,?(3)酶作用的底物。? 根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件,可设计出各种不同类型的检测方法。Р一、双抗体夹心法Р双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法,操作步骤如下:? 1.将抗体包被在固相载体上。? 2.如样品中含有抗原,则结合为抗原抗体复合物。? 3.再加入酶标记抗体,则结合为抗体-抗原-酶标记抗体复合物。? 4.酶催化底物并显色。Р+Р+Р+Р固相抗体标本酶标抗体底物显色Р二、间接法测抗体Р间接法是检测抗体最常用的方法。操作步骤如下:?1.将抗原包被在固相载体上。?2.如样品中含有抗体,则结合为抗原抗体复合物。?3.再加入酶标记抗抗体,则结合为抗原-抗体-酶标记抗抗体复合物。?4.酶催化底物并显色。Р+Р+Р+Р固相抗原标本酶标抗体底物显色Р三、酶标抗原竞争法Р竞争法可用于测定抗原,也可用于测定抗体。以测定抗原为例,受检抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合,因此结合于固相的酶标抗原量与受检抗原的量呈反比。? 1.将抗体包被在固相载体上。? 2.如样品中含有抗原,则优先竞争结合抗体,结合为抗原抗体复合物。? 3.同时加入酶标记抗原,抗原没有结合的位点酶标记抗原去占据,则结合为酶标记抗原-抗体复合物。? 4.酶催化底物并显色。РYYYР+РYYYР+РYYYР参考管Р酶标抗原РYYYР+РYYYР+РYYYР待测管Р酶标抗原Р抗原Р间接ELISA方法的建立Р1、抗原最佳包被液的选择;?2、抗原、血清和酶标二抗工作浓度的确定;?3、封闭液的选择;?4、封闭时间的优化;?5、血清稀释液的选择;?6、抗原抗体反应时间的优化。РELISA操作步骤Р以间接ELISA为例:?1、包被抗原:用包被液将抗原稀释至合适浓度,加入到酶标板中,每孔100µl,4℃过夜;?2、洗涤:弃去孔内液体,用洗涤液洗3次,每次 3min,最后用吸水纸拍干;
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