Taqman探针及SYBR Green I荧光染料技术

n探针法РTaqMan探针根据其3′端标记的荧光淬灭基团的不同分为两种:普通的TaqMan探针和TaqMan MGB探针。MGB探针的淬灭基团采用非荧光淬灭基团(Non-Fluorescent Quencher),本身不产生荧光,可以大大降低本底信号的强度。同时探针上还连接有MGB (Minor Groove Binder)修饰基团(图5),可以将探针的Tm值提高10°C左右。因此为了获得同样的Tm值,MGB探针可以比普通TaqMan探针设计得更短,既降低了合成成本,也使得探针设计的成功率大为提高。因为在模板的DNA碱基组成不理想的情况下,短的探针比长的更容易设计。实验证明,TaqMan MGB探针对于富含A/T的模板可以区分得更为理想。РTaqMan探针法РSYBR Green I荧光染料技术原理SYBR Green I是一种只与DNA双链结合的荧光染料(图6)。当它与DNA双链结合时,发出荧光;从DNA双链上释放出来时,荧光信号急剧减弱。因此,在一个体系内,其信号强度代表了双链DNA分子的数量。SYBR Green荧光染料法定量PCR的基本过程是:1、开始反应,当SYBR Green染料与DNA双链结合时发出荧光。2、DNA变性时,SYBR Green染料释放出来,荧光急剧减少。3、在聚合延伸过程中,引物退火并形成PCR产物。4、聚合完成后,SYBR Green染料与双链产物结合,定量PCR系统检测到荧光的净增量加大。РSYBR Green I荧光染料技术РSYBR Green I荧光染料技术РSYBR Green I荧光染料能与所有的DNA双链相结合,对DNA模板没有选择性,所以特异性不如TaqMan探针。要想用荧光染料法得到比较好的定量结果,对PCR引物设计的特异性和PCR反应的质量要求就比较高。在此前提下,本法是一种成本低廉的选择。Р常规PCR仪Р实时定量PCR仪