PCR原理及检测方法

PCR原理及检测方法Р一、PCR的定义:? PCR(polymerase chain reaction) :? 聚合酶链式反应,又称体外DNA扩增技术。? 近年来发展起来的一种体外扩增特异DNA片段的技术。РPCR技术:1985年由美国 Cetus 公司的Kary Mullis 首创,可以将微量目的DNA片段扩增一百万倍以上。? 优点:敏感度高、特异性强、产率高、重复性好以及快速简便等,广泛应用于微生物学、考古学、法医学及体育等领域,并已普及到许多普通实验室,大大简化了传统的分子克隆技术,从而比较容易地对目的基因进行分析、鉴定。? Kary Mullis 本人因此获1993年诺贝尔化学奖。Р二、PCR的原理:? 用于扩增位于两段已知序列之间的DNA片段,类似于天然DNA的复制过程。? 以拟扩增的DNA分子为模板,以一对分别与模板5′末端和3′末端互补的寡核苷酸片段为引物,在DNA聚合酶的作用下,按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成,重复这一过程,即可使目的DNA片段得到扩增。Р扩增的特异性取决于引物与模板DNA的特异结合,基本反应步骤分三步:?1. 变性(Denaturation):? 加热使模板DNA双链间的氢键断裂而形成两条单链。94℃ 30″?2. 退火(复性) (Annealling):? 突然降温后模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合,也存在两条模板链之间的结合,但由于引物的高浓度,结构简单的特点,主要的结合发生在模板与引物之间。55 ℃ 30 ″РPCR 的基本反应步骤Р变性?95˚CР延伸?72˚CР退火?Tm-5˚CРPCR扩增的特异性是由一对寡核苷酸引物所决定的。反应初期,原来的DNA担负起使模板的作用,随着循环次数的递增,由引物介导延伸的片段急剧增多而成为主要模板,最终的扩增产物是介于两种引物5’端之间的DNA片段。