制的遗传单位, 包括真核生物的细胞器(主要指线粒体和叶绿体) 和细菌细胞中染色体以外的 DNA 分子,在基因工程中质粒常被用做基因的载体。?是染色体外能够进行自主复制的遗传单位, 包括真核生物的细胞器(主要指线粒体和叶绿体) 和细菌细胞中染色体以外的 DNA 分子,在基因工程中质粒常被用做基因的载体。分离质粒 DNA 的基本步骤?培养细菌使质粒扩增; ?收集和裂解细菌; ?分离和纯化质粒 DNA 质粒 DNA 的提取方法?碱变性法(碱裂解法); ?煮沸裂解法; ?羟基磷灰石柱层析法; ?质粒 DNA 释放法; ?酸酚法等。碱变性( 裂解) 法基本原理: 在碱性条件下( pH 12.6 ),染色体 DNA 的氢键断裂,双螺旋结构解开而变性,质粒 DNA 氢键也大部分断裂,双螺旋也有部分解开,但共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离,当以 pH 4.8 的乙酸钠将其 pH 调到中性时,变性的质粒 DNA 又恢复到原来的构型,而染色体 DNA 不能复性, 形成缠绕的致密网状结构,离心后,由于浮力密度不同, 染色体 DNA 与大分子 RNA 、蛋白质 SDS 复合物等一起沉淀下来而被除去。原理示意图质粒 DNA 电泳电场中 DNA 分子的迁移速度取决于: ?DNA 分子本身的大小?DNA 分子的空间构型–超螺旋构型( ccDNA) –线形 DNA(lDNA) –开链环状 DNA(ocDNA) –复制中间体(没有复制完的两个质粒连在一起) ?溴化乙锭( EB)是一种荧光染料(3,8- 二氨基-5- 乙基-6苯基菲啶溴盐),其分子可以嵌入到核酸的碱基对之间,在紫外线的激发下,发出橙色荧光 Attention, please! ?EB是强诱变剂,配制和使用 EB染色液时, 应带乳胶手套或一次性手套,并且不要将该染色液洒在桌面或地面上,凡是沾污 EB 的器皿或物品,必须进行清洗或弃去!
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